一、什么是熒光標(biāo)記？

   熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，受到紫外光或藍(lán)紫光照射時(shí)，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時(shí)，發(fā)出熒光。熒光標(biāo)記技術(shù)指利用熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來(lái)提供被研究對(duì)象的信息。熒光標(biāo)記的無(wú)放射物污染，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，使得熒光標(biāo)記物在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。二、熒光標(biāo)記的作用

  熒光標(biāo)記物質(zhì)在蛋白的功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用。人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的活性，并將其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選和藥物開(kāi)發(fā)（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。因此，多肽的熒光修飾，同樣是多肽合成領(lǐng)域的重要內(nèi)容。

  三、熒光標(biāo)記的位點(diǎn)

  熒光標(biāo)記物質(zhì)可以直接和多肽的N端直接相連（如異硫氰酸熒光素的連接， 通常在多肽的N端和異硫氰酸熒光素直接插一個(gè)氨基乙酸或者β-丙氨酸。），或者在C端和賴氨酸（或半胱氨酸）的側(cè)鏈連接、或者在其它可以連接的位子連接。

  四、熒光標(biāo)記的舉例

  4.1 FITC修飾 異硫氰酸熒光素（FITC）具有比較高的活性，通常來(lái)說(shuō)，在固相合成過(guò)程中引入該種熒光基團(tuán)相對(duì)于其他熒光素要更容易，并且反應(yīng)過(guò)程中不需要加入活化試劑。FITC修飾的多肽通常主要有兩種形式：（1）在整條肽鏈N端接入FITC，并且在FITC之前接入一分子的Acp（6-氨基己酸），也稱烷基間隔器。反應(yīng)中FITC與肽鏈上 ** 的-NH2反應(yīng)，Acp的接入提供了六個(gè)碳的直鏈空間，大大降低了反應(yīng)的空間位阻，提高了反應(yīng)效率，降低了反應(yīng)難度。其次，F(xiàn)ITC還與多肽結(jié)構(gòu)中的-SH，側(cè)鏈-NH2反應(yīng)，Acp的加入也降低了這種副反應(yīng)發(fā)生的可能。此外，多肽在酸性環(huán)境條件下切割時(shí)，在N端接入FITC的多肽需要經(jīng)歷環(huán)化作用來(lái)形成熒光素，這種過(guò)程通常都會(huì)伴隨最后一個(gè)氨基酸的切除，而烷基間隔器Acp的接入就避免了這一情況的發(fā)生。（2）在整條肽中的某個(gè)Lys側(cè)鏈接入FITC，Lys側(cè)鏈為末端為-NH2的四碳直鏈烷基，直接起到了降低空間位阻的作用。這種修飾方式能夠靈活的在整條肽中任何位置進(jìn)行FITC修飾，而不僅僅局限于末端。

  (圖解FITC修飾)

  4.2 AMC修飾 7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）是一種應(yīng)用廣泛的熒光標(biāo)記試劑，例如，酶的痕量測(cè)定，酶的鑒定，激光染料的制備等多種用途，此外，C端用香豆素修飾的泛素分子也是研究蛋白質(zhì)泛素化過(guò)程的重要探針。 與其他熒光染料不同的是，AMC修飾多肽分子是從C端進(jìn)行：（1）AMC與肽鏈C端第一個(gè)氨基酸反應(yīng);（2）固相合成整條肽鏈（從第二個(gè)氨基酸開(kāi)始），并且保留整條肽鏈的側(cè)鏈保護(hù)基和最后一個(gè)氨基保護(hù)基；（3）液相縮合AA-AMC與全保護(hù)的肽鏈；（4）切除保護(hù)基，完成肽鏈的修飾。

  (圖解AMC修飾)

  4.3 5-FAM修飾

  通常用于激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)的運(yùn)用。

  4.4 Rhodamine B（羅丹明 B）修飾

  羅丹明B是眾多羅丹明染料中的一種，用于熒光測(cè)定。

  4.5 5-TAMRA 修飾

  5-TAMRA是用于標(biāo)記肽和蛋白質(zhì)的最流行的橙色熒光團(tuán)之一。

  4.6 Cy 3和 Cy 5修飾

  Cy3 and Cy5 是高消光系數(shù)的染料。因此，它們特別適用于細(xì)胞內(nèi)敏感的多肽定位實(shí)驗(yàn)。它們的缺點(diǎn)是在多肽合成的環(huán)境中非常的不穩(wěn)定，因此合成的量相對(duì)低。

  Cy 3

  Cy5

  五、常見(jiàn)熒光物質(zhì)波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)